La culture des phages au lycée

Auteur : Christian Bois

Plusieurs sources dont BioOutils

Equipement nécessaire

N.B. : Le terme de « phage » désigne ici les phages-gardiens

Objectifs de l’expérience

Observer indirectement l’existence des phages-gardiens dans la nature.

Les phages-gardiens sont les « bons » virus prédateurs des bactéries.

On prend comme exemple Escherichia coli qui est une des bactéries les plus courantes à la fois :
– comme composante de la flore intestinale – 80 %
– comme pathogène – par exemple dans des cas de cystite
– comme « habitante » des eaux et des forêts

Résumé de la méthode

1_Récolter de l’eau dans laquelle on espère trouver un phage anti-Escherichia coli
2_Cultiver ce phage sur des bactéries Escherichia coli
3_Vérifier qu’il y avait effectivement ce phage dans l’eau récoltée

Où trouver des phages ?

Si c’est pour juste voir des phages, l’eau d’une rivière qui est passée dans une ville convient.
Si l’on veut des phages pour des bactéries dangereuses les égouts d’un hôpital sont une meilleure source.
Attention !!! S’il y a des phages c’est qu’il y a des bactéries qui peuvent être mortelles !!! Plus la source est dangereuse, plus on doit respecter un protocole de sécurité – gants, masque, lunettes, etc.

Le phage lui-même est spécifique = sans danger

Le phage n’attaque qu’une espèce ou sous-espèce de bactérie. Contrairement à l’antibiotique, il ne va pas détruire la flore intestinale de manière aveugle.

Prélèvement de l’eau

Mettre des gants, prendre un tube propre, recueillir l’eau – à la sortie d’une station d’épuration par exemple – fermer le tube. Jeter les gants dans un endroit idoine.

Matériel dans le laboratoire et organisation stérile

L’organisation doit être telle qu’il n’y ait pas contamination entre l’amont – le tube de recueil qui contient aussi des bactéries diverses – et l’aval : la zone de culture.

Il faut un filtre stérile pour seringue.

Illustration 1 : Filtre stérile 0,45 µm pour seringue Source : LaboAndCo

Le filtre laisse passer les phages qui sont plus petits et bloque les bactéries qui sont plus grosses que les pores du filtre.

Il faut un milieu de culture correspondant à la bactérie dont on veut étudier le phage.

Si l’on veut étudier Escherichia Coli il faut disposer d’un échantillon de cette bactérie.

Pour Escherichia Coli il faut du milieu de culture LB (Pour lysogeny broth ou incorrectement milieu Luria-Bertani).

Il faut une boite de Petri avec gelose pour Escherichia coli.

Séparation bactéries / phages

L’eau doit être recueillie le jour même ou la veille.
Mettre l’eau dans une seringue et passer dans le filtre stérile 0,45 µm.
On nomme « PR » le tube dans lequel on a notre eau avec Phages Récoltés.

Culture des bactéries et des phages

Si l’on a 10 ml dans le tube PR, ajouter 1 ml de milieu de culture LB et une tête d’épingle de Escherichia coli. Maintenir à 37° pendant 24 heures.

On a deux temps :
– Temps 1 : les bactéries se développent dans le milieu de culture
– Temps 2 : les phages attaquent les bactéries

Jour suivant : séparation bactéries / phages

Faire passer le contenu du tube PT dans un filtre neuf  :
– le filtre bloque les Escherichia coli morts et éventuellement quelques vivants restant
– il laisse passer l’eau dans laquelle il y a des phages anti-Escherichia coli

On nomme PC le tube avec les Phages Cultivés qui se sont développés sur Escherichia coli.
On peut garder le tube PCà 4°, les phages étant plutôt stables.

Mise en contact des phages cultivés et d’Escherichia coli

Dans 5ml d’eau physiologique stérile, mettre un peu d’Escherichia coli – la même que précédemment. On nomme ce mélange BE = bactérie + eau.

Sur la boite de Petri, « peindre » la surface de la gélose avec le mélange BE.

 

Dans le quadrant 1 mettre une tache de l’eau avec les Phages Récoltés dans la rivière – tube PR
Dans le quadrant 2 mettre une tache de l’eau avec les Phages Cultivés – tube P
Dans le quadrant 3 mettre une tache de suspension de bactériophage T4 spécifique contre E. coli (contrôle positif)
Dans le quadrant 4 mettre une tache d’eau physiologique stérile (contrôle négatif)

Incuber la boite à l’envers à 37 °C de 12h à 24 h ; la boite peut ensuite être conservée à 4°C.

Références

Proposées par BiOutils.

Films-documentaires:

• Cent regrets M. d’Herelle (2013). Film Octopussyprod

Lien RDM video : http://www.rdm-video.fr/film-dvd/V61263/cent-regrets-m-d-herelle.html

• Bactéries résistantes: des virus au secours des malades (2013). Emission 36.9, RTS

Lien RTS : http://www.rts.ch/emissions/36-9/5102290-bacteries-resistantes-des-virus-au-secours-des-malades.html

• Virus contre bactéries: une solution à la crise des antibiotiques? (2011) Un film de Stefanie Schmidt.

Lien dailymotion: http://www.dailymotion.com/video/xocrd3_virus-contre-bacteries-une-solution-a-la-crise-des-antibiotiques_tech

• La guerre des phages (2005). Un film de Lindalee Tracey

Lien youtube : https://www.youtube.com/watch?v=nVD5tYE8oyI

Livres:

• La phagothérapie: des virus pour combattre les infections. Renouveau d’un traitement au secours des antibiotiques. 2017, Alain Dublanchet, Editions Favre (Français, 252 pages)

• Viruses vs superbugs: a solution to the antibiotics crisis? 2007, Thomas Hausler, Macmillan (anglais, 256 pages)

Et encore:

• Site web d’information sur la phagothérapie: phageback.ch et atelier pour les enseignants:https://wp.unil.ch/phageback/2015/09/phagotherapie-formation/
• Ateliers à L’Eprouvette (Lausanne):http://wp.unil.ch/mediationscientifique/2015/phageback-ateliers-debats/
• Références scientifiques: http://www.phagoburn.eu/

 L’expérience de BiOutils a été mise en place en collaboration avec Johan Roelant, Maria Gaulin et Carmen Diz Salgado du Collège Voltaire.

.

.

.

Source : Boite de Petri WikiMédia